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水产常见菌(乳酸菌)

        乳酸菌是一类不运动、无芽孢、能利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称,包含44个种,连同亚种共51个种,分9个属,其中5个属呈球状,如乳酸球菌、链球菌等;4个属呈杆状,如乳酸杆菌、双歧杆菌等。乳酸菌在自然界分布非常广泛。

1. 乳酸菌的培养

1.1 培养工具

        紫外线消毒灯、吸管、量杯、不透光的塑料桶

1.2 培养方法

1.2.1 使用工具的消毒灭菌:将吸管、量杯、塑料桶等工具放置于紫外灯下照射30分钟,玻璃容器可采用酒精或开水进行消毒灭菌。

1.2.2 培养基的配置:将购置的1瓶培养基添加10升纯净水摇匀至全部溶解即可。

备注:培养基的配制一定要使用纯净水;配制完成的培养基配使用比例为50倍,即1000毫升菌液加20毫升培养基即可;培养基在使用之前应充分摇匀;配制完成的培养基置于室内阴凉干燥处避光可保存一年。

1.2.3 扩培方法

1.2.3.1 接种比例:100 ml菌:400 ml纯净水:10 ml培养基即菌种:纯净水:培养基为10:40:1。

1.2.3.2 接种步骤:取100 ml菌种加入400 ml纯净水再加入10 ml培养基后充分混匀密封,放置于高温避光处生长,培养5-7天左右观察颜色是否变深,如菌液颜色明显加深则可继续按照比例分扩。

1.2.3.3 培养管理

a. 调节温度:保持培养温度稳定在30 ℃左右为宜。
b. 光照:培养过程中应放置于避光处。
c. 观察和检查:检查菌液是否出现异常颜色、大量沉淀、附壁、水。如培养液表面出现菌膜、菌液混浊等均为生长不正常的现象,应及时处理。

2. 乳酸菌在水产上的应用

2.1 乳酸菌在水质改良上的应用

2.1.1 集约化养殖的水环境现状

       随着集约化养殖模式的发展,抗生素作为抗菌促生长药物广泛地应用于水产养殖过程中,并且对水产动物的健康和快速生长做出了巨大的贡献,部分抗生素会经过消化吸收后以代谢物的形式排出,而大多数则是以原型排出,因此水产动物频繁使用抗生素则会对水环境造成一定的污染,并且长此以往还会对赖以生存的人和其它生物构成潜在的威胁。梁惜梅等调查了珠江口典型水产养殖区除β-内酰胺类的其它四大类抗生素的污染特征后发现:喹诺酮类>四环素类>大环内酯类,而磺胺类未在调查水域检出。此外沉积物中抗生素的检出率和种类均比水中要高,这说明以粪便形式排出的抗生素会慢慢的在沉积物中积累,然后再逐渐释放回水中,从而造成水环境的污染。

2.1.2 乳酸菌净化水质的机理及效果

        以饲料形式投喂的乳酸菌一部分可以在养殖动物肠道内定植,而大部分则通过粪便排泄到水中,从而使水体中的乳酸菌的数量升高并成为优势菌种。其功效主要表现在两个方面,一方面可通过竞争抑制养殖动物肠道和水体中的弧菌,另一方面还可通过直接(化学作用)或间接(反硝化作用)作用消除水体中的亚硝酸盐,从而起到净化水质的效果。武鹏等使用免疫增强剂(乳酸菌、芽孢杆菌为主)、复合芽孢杆菌和EM菌(不含乳酸菌)饲喂刺参幼参,结果表明三种微生态制剂虽不能完全消除水体中的粪便和残饵,但是均可降解铵态氮和亚硝态氮,其中免疫增强剂组虽然对水质净化作用最差,但对养殖动物的生长促进效果最好。此外乳酸菌也可作为水质改良剂直接泼洒到水体中,盖建军等进行的相关试验表明乳酸菌对降低水体中的亚硝态氮有很好的效果,但是对其它水质指标改善效果较差,而以乳酸菌、芽孢杆菌和光合细菌为主要成分的EM菌则对水体中的溶解氧、pH值、氨氮、亚硝态氮均具有较好的调控效果。因此,乳酸菌直接泼洒到水体中虽然具有一定的水质改良效果,但是单独使用效果并不理想,所以要根据实际生产情况,选择合适的菌种或者直接使用EM菌以满足养殖过程中的不同需求。

2.2 乳酸菌在治疗水产动物疾病方面的应用

        乳酸菌作为目前应用最为广泛的一类益生菌,在养殖动物肠道定植后可实现有效的自我增殖,其代谢产物可有效改善水产动物胃肠道微环境。肠炎作为水产养殖过程中最易爆发的疾病,其致病菌主要包括肠型点状气单胞菌和温和气单胞菌,而海水养殖动物的主要病原菌则为弧菌,存在于水体和肠道内。实际生产过程中养殖户为了避免该类疾病的爆发便会选择在饲料中添加抗生素,低剂量长期服用含抗生素的饲料会使养殖动物肠道菌群失调从而加重肠炎,并且极大程度上增加了耐药菌株产生的可能性,从而造成抗生素的失效,加大治疗难度。现有相关研究显示乳酸菌对养殖动物肠道疾病如气单胞菌引起的肠炎和腹泻具有一定的预防和治疗作用,且乳酸菌调节肠道菌群的能力则主要取决于其在肠道中的定植能力、定植位点以及定植后的代谢产物。

2.2.1 乳酸菌在肠道中的定植能力

       乳酸菌的定植能力主要受两方面因素的影响,一方面取决于菌类细胞和肠粘膜的亲和力,另一方面则取决于环境中是否存在该菌种及存在的数量。研究显示乳酸菌可以通过脂磷壁酸以及菌体分泌的表面蛋白对肠道粘膜细胞产生强大的粘附作用。通常刚孵化的鱼类胃肠道是无菌的,但当与环境和饲料接触后,一些能够适应鱼类胃肠道的微生物便陆续定植,通过在饲料中添加乳酸菌或直接泼洒到水中均可以显著影响其肠道定植菌群的种类及数量。因此,在养殖过程中可以在饲料或水中投放筛选好的定植能力较强的乳酸菌,使其在养殖动物肠道中迅速定植并成为优势菌种,从而改变肠道菌群的发展趋势。

2.2.2 乳酸菌在肠道中的定植位点

        乳酸菌益生效应的高低取决于其定植位点是否与致病菌的黏附受体相同或相近,否则难以发挥效应。一般认为乳杆菌属的多数菌是通过其表层蛋白介导菌体与宿主的粘附,在养殖动物体内产生胞外糖苷酶,降解肠道细胞壁上复杂的多糖成分,从而减少肠粘膜上病原菌的受体,降低病原菌的定植和入侵。研究显示乳酸杆菌Barl3具有很强的定植能力,能将68%的大肠杆菌H10407和90%的猪霍乱沙门氏菌从定植部位移除。王福强等人的研究表明从牙鲆肠道分离的两种乳杆菌均能在肠道定植,并且可以明显抑制小肠部位弧菌的繁殖,陈营等也有相似的发现。夏磊等研究则显示复合乳酸菌对肠型点状气单胞菌感染引起的肠炎具有一定的治疗效果,能推迟发病时间并减少死亡数量,但是效果并不明显。但也有研究证明饲料中添加乳酸菌的抗病效果与养殖动物的种类具有很大的关系,如投喂添加乳酸菌的饲料对斑节对虾肠道中弧菌数量影响并不显著。因此,结合相关研究与实践发现乳酸菌虽然对养殖动物肠炎疾病的治疗具有一定的效果,但却不能作为疾病爆发时的首选,而在养殖过程中通过科学合理的方式提高水产动物的免疫力,并且做好疾病的防治工作则显得更为重要。

2.2.3 乳酸菌代谢产物对肠道菌群的影响

2.2.3.1 水产动物肠道菌群的分布

        研究显示同种鱼类的肠道菌落分布数量前肠段小于中肠段和后肠段,同一肠段的厌氧菌数量高于需氧菌,一般相差2~3个数量级,而不同种鱼类不同肠段的好氧菌数量相差很大,但厌氧菌总数却相差不大。其中淡水鱼类肠道内专性厌氧菌以A、B型Bacteroides(拟杆菌属)等为主,好氧和兼性厌氧细菌以Aeromonas(气单胞菌属)、Enterobacteriaceae(肠杆菌属)等为主,而海水鱼类肠道菌群则相对简单,主要以弧菌为主。健康的肠道菌群能够对养殖动物的生长、消化和免疫起到促进作用,研究中通过增加养殖动物肠道厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的数量,减少好氧菌、产气荚膜梭菌的数量能有效促进养殖动物的生长发育,并在一定程度上起到防病抗病作用。

2.2.3.2 乳酸菌代谢物对肠道菌群的调节

       乳酸菌在养殖动物肠道定植后,通过自身营养物质的竞争能力、调节肠道微环境等对肠道内菌群起到相应的调节作用。首先,乳酸菌对利用养殖动物肠道中的可溶性碳水化合物合成大量的有机酸和细菌素等物质具有很强的竞争力;其次,可有效降低肠道内pH值,并刺激肠道蠕动,从而加速病原菌的外排,同时也抑制了大肠杆菌、沙门菌、梭菌等有害菌的繁殖;此外,由于其兼性厌氧的特性通过消耗肠道内的氧气,从而抑制有害需氧菌的繁殖,从而调节肠道内的菌群。

2.3 乳酸菌对水产动物免疫的影响

       鱼类虽为低等脊椎动物,但已具备了免疫的基本能力,其免疫应答器官与组织主要包括前肾、脾脏、胸腺、消化道淋巴及血液淋巴等,其免疫调节机制包括吞噬细胞、补体、干扰素及溶菌酶等非特异性免疫、以抗体为主的体液免疫及以T细胞为主的细胞免疫的特异性免疫,还具有以黏膜反应免疫为主的局部免疫。相对于高等脊椎动物鱼类更依赖于非特异性免疫调节;甲壳动物则是以非特异性免疫为主,并无特异性免疫。

        乳酸菌的免疫调节功能主要是通过加强养殖动物肠黏膜屏障功能及其免疫功能发挥作用来实现的。Ouwehand等认为益生素对免疫系统的刺激作用是通过抗原性物质以代谢物小分子的形式直接进入淋巴组织或自身细胞通过胞饮作用进入淋巴组织后,经抗原呈递细胞处理或直接交给淋巴细胞,从而产生相应的免疫应答来实现的。乳酸菌可以通过刺激黏膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平,从而增强体液免疫;还可以通过促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖,从而加强细胞免疫;亦或可以通过增强单核吞噬细胞、多形核白细胞的活力,刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子的分泌,从而加强非特异性免疫反应。王国霞等研究证明通过在饲料中添加嗜酸乳酸菌能显著性影响血清中的溶菌酶和过氧化氢酶,从而提高SOD和酚氧化酶的活性,刘小玲等也有相似的研究发现。Son等和廖志勇等均发现植物乳杆菌不仅可以提高石斑鱼血清溶菌酶活性,还可显著提高巨噬细胞的活性、吞噬指数及头肾白细胞的爆发性呼吸力;管魁等研究则发现乳酸菌的代谢产物对刺参幼体的体腔细胞数量、吞噬活性及免疫酶活性等免疫指标也具有显著的促进效果。

3. 乳酸菌在水产养殖业的应用前景

        随着科技的发展,乳酸菌已经越来越多的被应用到水产养殖过程中,但是由于水产动物种类、大小的复杂性,其作用机理的研究尚不透彻,仍需进一步的深入研究。结合现有研究实践经验,单一菌种使用存在很多限制性,而配合芽孢杆菌、光合细菌和硝化细菌等有益菌共同使用,其效果更为明显。为了满足生产实践的实际需求,相关的研究将不断的深入完善,未来乳酸菌将能更科学、更规范的代替抗生素应用于水产养殖业。